探討細胞應激后，CASP2在泛素化穩(wěn)態(tài)中的作用，特別是其在超載泛素化調(diào)節(jié)中的角色。實驗思路解析：

1. 細胞組分分離：使用HeLa細胞，分離出三種細胞組分：可溶性I（Soluble I）、可溶性II（Soluble II）和顆粒部分（Pellet），以檢測不同應激條件下的泛素化水平。

2. 應激處理：細胞接受熱休克（HS）或硼替佐米（BTZ）處理，觀察這兩種處理對可溶性II和顆粒部分中泛素化水平的影響。

3. 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析：對HS或BTZ處理后的顆粒部分進行LC-MS/MS分析，篩選出204個常見的候選蛋白，進一步分析其在應激條件下的富集情況。

4. 蛋白質(zhì)富集分析：重點關(guān)注與蛋白質(zhì)質(zhì)量控制（PQC）相關(guān)蛋白，如DAXX、TRIM11、SQSTM1和UBXN1，這些蛋白在顆粒部分中特異性富集，提示它們在應激下發(fā)揮功能。

5. CASP2角色驗證：觀察CASP2在應激處理后的積累情況，發(fā)現(xiàn)其在可溶性II和顆粒部分中增加，表明其可能參與調(diào)節(jié)泛素化。

6. CASP2敲除實驗：構(gòu)建CASP2敲除（CASP2-KO）HEK293T細胞系，評估CASP2缺失對泛素化的影響，發(fā)現(xiàn)缺失CASP2后，細胞在恢復階段的多聚泛素化綴合物積累。

7. 泛素化動態(tài)監(jiān)測：通過觀察Ubc9ts的泛素化變化，發(fā)現(xiàn)CASP2缺失降低了其周轉(zhuǎn)率，且在恢復過程中，CASP2-KO細胞中仍有未去除的泛素陽性斑點。

 結(jié)論：CASP2在細胞應激后被招募到不溶性部分，并在調(diào)節(jié)超載泛素化中發(fā)揮重要作用。CASP2的缺失導致應激誘導的泛素化綴合物積累，影響細胞的蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)。

圖1 ：CASP2 維持應激后泛素穩(wěn)態(tài)

探究缺陷對細胞應激反應的影響，采用基于串聯(lián)泛素結(jié)合實體（TUBE）的泛素組學分析，以檢測在熱休克（HS）后CASP2缺失（CASP2-KO）細胞中積累的泛素化蛋白。研究思路解析：

1. 細胞分級：首先對熱休克處理后的細胞進行分級，丟棄可溶性I級分，保留剩余的級分進行后續(xù)分析。將這些級分與固定的TUBE珠孵育，以捕獲泛素化的蛋白質(zhì)。

2. 數(shù)據(jù)分析：通過定量質(zhì)譜（MS）分析TUBE捕獲的蛋白質(zhì)，比較恢復組與HS組中捕獲蛋白質(zhì)的強度。計算恢復組與HS組中蛋白質(zhì)的比率，發(fā)現(xiàn)CASP2-KO細胞中超過80%的蛋白質(zhì)表現(xiàn)出更高的泛素化水平，表明這些蛋白質(zhì)在缺乏CASP2的情況下過度泛素化。

3. 篩選與富集分析：篩選出116種不同的蛋白質(zhì)進行進一步的富集分析，其中11種蛋白質(zhì)與肌wei縮側(cè)索硬化癥（ALS）高度相關(guān)，包括TDP-43和TBK1。研究表明，TDP-43和TBK1的過度泛素化和磷酸化是ALS的病理特征。

4. 功能驗證：通過拉下實驗（pull-down assay）確認CASP2-KO細胞中TDP-43的泛素化水平顯著高于對照細胞，并且其周轉(zhuǎn)率較低。觀察到在熱休克或BTZ處理的細胞中，CASP2與磷酸化的TDP-43共定位，且CASP2-KO細胞在熱休克后積累了更多的pTDP-43。

5. 細胞生存分析：CASP2-KO細胞的集落形成效率降低，對BTZ處理更敏感，細胞死亡率升高，進一步證明CASP2缺失導致細胞內(nèi)異常的蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)和病理性蛋白聚集。

結(jié)論：CASP2在維持細胞應激后的蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮關(guān)鍵作用，其缺失會導致有毒蛋白質(zhì)的聚集，這與神經(jīng)退行性疾病的病理變化密切相關(guān)。

圖 2：CASP2 缺陷不利于蛋白質(zhì)組應激后細胞穩(wěn)態(tài)

對缺陷小鼠的運動缺陷進行了深入分析，思路解析如下：

1. 運動功能評估：研究發(fā)現(xiàn)，10-14月齡的CASP2敲除小鼠表現(xiàn)出明顯的后肢抓握障礙，運動功能受損。這些小鼠在轉(zhuǎn)棒測試和握力測定中顯示出運動能力下降，步態(tài)分析顯示步幅縮短和運動速度降低。

2. 神經(jīng)肌肉連接分析：通過肌電圖測量，發(fā)現(xiàn)CASP2缺失小鼠的肌源性運動誘發(fā)電位較低，且靜息肌電圖記錄顯示腓腸肌存在自發(fā)性顫動。這表明上運動神經(jīng)元和下運動神經(jīng)元之間的連接存在缺陷。此外，CASP2缺失小鼠的神經(jīng)肌肉接頭（NMJ）數(shù)量增加，而脊髓中膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶陽性神經(jīng)元的數(shù)量減少，進一步證實神經(jīng)肌肉去神經(jīng)支配的現(xiàn)象。

3. 病理蛋白聚集分析：還觀察到，CASP2缺失小鼠的初級運動皮層和脊髓中，Lys48-Ub陽性斑點的數(shù)量和大小均顯著增加，這些斑點與累積的pTDP-43共定位。這表明TDP-43的泛素化和病理性聚集與CASP2缺失小鼠的運動缺陷相關(guān)。

4. 建立TDP-43模型：為進一步驗證CASP2在TDP-43相關(guān)疾病進展中的作用，對新生小鼠進行AAV-TDP-43注射。結(jié)果顯示，CASP2缺失小鼠的初級運動皮層中GFP-TDP-43的強度高于對照組，且在不溶性顆粒中積累的GFP-TDP-43更多。這表明CASP2缺失加速了TDP-43病理表型的發(fā)展。

5. 對運動行為的影響：運動行為實驗表明，注射AAV-TDP-43的CASP2缺失小鼠表現(xiàn)出更嚴重的運動損傷，靜息肌電圖記錄顯示運動單位高頻自發(fā)放電顯著增加。這些結(jié)果進一步支持了CASP2在維持蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)和神經(jīng)肌肉連接中的重要作用。

結(jié)論：CASP2缺失小鼠的運動缺陷與病理性蛋白質(zhì)聚集、神經(jīng)肌肉去神經(jīng)支配及TDP-43的異常表達密切相關(guān)，提示CASP2在神經(jīng)退行性疾病中的潛在作用。

圖 3：CASP2 缺陷小鼠表現(xiàn)出運動缺陷

探討了caspase-2（CASP2）在細胞應激條件下的作用，特別是它如何參與形成一種新的富含泛素修飾蛋白的生物分子凝聚物，即泛素應激小體（Ubstressome）。這種凝聚物在細胞應激反應中發(fā)揮重要作用，該凝聚物通過液-液相分離形成，通常在細胞核周圍存在，主要成分包括過載泛素修飾的底物、蛋白酶體和CASP2。研究思路解析：

 實驗方法：

（1）免疫共沉淀：通過免疫共沉淀技術(shù)，研究人員確認了CASP2與泛素化蛋白的相互作用。

（2）熒光實驗：使用穩(wěn)定表達的單體GFP標記的CASP2，觀察其在HEK293T細胞中的動態(tài)分布。研究發(fā)現(xiàn)，CASP2在應激處理后逐漸濃縮并形成可見的淚點，這表明其參與了凝聚物的形成。觀察到CASP2與Ubc9ts的共積累，進一步支持了其在液-液相分離中的作用。

 主要結(jié)果：

（1）凝聚物的形成：CASP2與多聚泛素鏈形成液體狀的凝聚物，且這些凝聚物在光漂白后能夠恢復，顯示出液體特性。

（2）大復合物的鑒定：通過尺寸過濾色譜，發(fā)現(xiàn)CASP2參與了一個分子量接近2000 kDa的大復合物，且該復合物中富含與應激相關(guān)的泛素化底物。

（3）相分離特性：使用PhaSePred預測相互作用子的相分離特性，發(fā)現(xiàn)可溶性II級分中的潛在相互作用子更可能發(fā)生相分離。

結(jié)論：CASP2在細胞應激反應中通過形成泛素應激小體參與蛋白質(zhì)質(zhì)量控制。這一發(fā)現(xiàn)為理解細胞如何應對應激提供了新的視角，強調(diào)了CASP2在泛素化調(diào)節(jié)中的重要性。未來進一步研究CASP2與其他蛋白質(zhì)的相互作用及其在細胞應激反應中的具體機制，將有助于揭示其在細胞生物學中的更廣泛功能。

圖 4：CASP2 整合到泛素陽性縮合物中

CASP2調(diào)控過載泛素的機制進行了深入探索，發(fā)現(xiàn)CASP2通過其UIML區(qū)域與超載的泛素鏈結(jié)合。研究思路解析：

 1. CASP2的結(jié)構(gòu)與功能：

（1）CARD域的重要性：CASP2包含一個保守的半胱天冬酶激活和招募結(jié)構(gòu)域（CARD），該域?qū)τ谛纬杉毎麅?nèi)的模塊結(jié)構(gòu)至關(guān)重要。

（2）UIML域的發(fā)現(xiàn)：研究者發(fā)現(xiàn)CARD域中的一個保守序列（Phe102-Thr109，F(xiàn)CEALRET）與經(jīng)典的泛素結(jié)合域（UIM）相似，能夠在體外與泛素形成凝聚體。

 2. 突變體分析：通過構(gòu)建UIML殘基突變體（如CARD-3A和CARD-3E），研究者發(fā)現(xiàn)這些突變體無法結(jié)合泛素鏈，表明UIML域在結(jié)合泛素鏈中起關(guān)鍵作用。CASP2的CARD結(jié)構(gòu)域被證明能夠在體外與多聚泛素鏈結(jié)合，而缺失CARD域的突變體則失去這種能力。

 3. 熱休克的促進作用：熱休克條件下，CASP2的CARD域與細胞裂解物中的泛素鏈結(jié)合顯著增強，而UIML突變體則未能表現(xiàn)出這種結(jié)合能力。

 4. 細胞內(nèi)行為的觀察：

（1）凝聚物的形成：在細胞中，野生型CARD結(jié)構(gòu)域（CARD-WT）能夠形成凝聚物，而UIML突變體則保持彌散分布，表明UIML域?qū)ASP2的聚集至關(guān)重要。

（2）超載泛素化的影響：使用泛素激活酶（E1）抑制劑的處理，阻斷超載的泛素化，導致CASP2無法形成可檢測的斑點，進一步證明了CASP2的招募依賴于超載泛素鏈的形成。

結(jié)論：CASP2通過其CARD結(jié)構(gòu)域中的UIML域結(jié)合超載的泛素鏈，這一結(jié)合對于CASP2的招募到副應激體中是bi不可少的。這一發(fā)現(xiàn)為理解CASP2在細胞應激反應中的作用提供了新視角。

圖 5：CASP2綴合物與超載泛素化高度相關(guān)

CASP2（半胱天冬酶-2）具有針對超載泛素化的去泛素化酶（DUB）活性，這為理解其在細胞應激反應中的作用提供了新視角。

作者推測CASP2可能具有DUB活性，因為其對泛素的作用與許多已知的DUB相似。USP21的過表達會減少細胞中的整體泛素鏈庫，而CASP2則僅減少過量的泛素鏈，這表明CASP2的DUB活性特異性針對超載的泛素化。驗證思路解析：

1. CASP2的活性檢測：通過觀察CASP2在細胞中的表達和活性形式（全長CASP2和缺失CARD的CASP2）對異位表達的泛素鏈的影響，確認其去泛素化能力。研究發(fā)現(xiàn)，CASP2能夠顯著降低細胞中外源性泛素鏈的水平。

2. 突變研究：通過突變分析，確定了CASP2催化口袋中的關(guān)鍵氨基酸殘基，這些殘基可能參與泛素的識別和切割。特別是，Arg 219、Gln 318和Ala 376的突變會阻止CASP2對泛素鏈的裂解，表明這些位點在CASP2的DUB活性中起關(guān)鍵作用。

3. 細胞凋亡的關(guān)聯(lián)：研究還發(fā)現(xiàn)，CASP2的DUB活性與細胞凋亡之間存在聯(lián)系。某些突變體（如L439A）在保持去泛素化活性的同時，顯著減少了細胞凋亡，表明CASP2的DUB活性可能在應對蛋白質(zhì)組應激時保護細胞。

4. 酵母模型的驗證：研究還擴展到酵母模型，發(fā)現(xiàn)酵母中的半胱天冬酶同源物MCA1在應激條件下也能切割泛素鏈，支持CASP2在維持泛素穩(wěn)態(tài)中的進化保守功能。

結(jié)論：CASP2被確認具有針對超載泛素鏈的去泛素化活性，這一發(fā)現(xiàn)不僅揭示了其在細胞應激反應中的新角色，也為理解細胞如何處理蛋白質(zhì)聚集提供了重要線索。

圖 6：CASP2 通過 UIML 結(jié)合超載泛素鏈

圖 7：CASP2 是針對超載泛素鏈的 DUB

CASP2在維持細胞內(nèi)泛素化穩(wěn)態(tài)方面扮演著關(guān)鍵角色。本研究主要發(fā)現(xiàn)：

1.CASP2的功能：

（1）去泛素化活性：CASP2是重要的蛋白酶，能夠恢復因應激而超載的泛素化綴合物的穩(wěn)態(tài)。它通過其泛素結(jié)合的UIML區(qū)域被招募到這些綴合物中，并作為去泛素化酶（DUB）促進底物的降解，從而減輕蛋白質(zhì)的毒性狀態(tài)。

（2）du特的切割模式：CASP2的切割偏好與傳統(tǒng)的半胱天冬酶不同，它能夠靶向多聚泛素鏈，這一發(fā)現(xiàn)加深了對半胱天冬酶切割特異性的理解。

（3）細胞保護作用：CASP2在細胞健康中發(fā)揮保護作用，尤其是通過減少病理蛋白TDP-43的積累，表明它在應對細胞應激和維持細胞穩(wěn)態(tài)方面的重要性。

2.生物分子凝聚物：

在應激條件下，超載泛素化綴合物與蛋白酶體形成生物分子凝聚物（副應激體）。與副應激體形成有關(guān)的因素包括過度合成泛素并形成多泛素鏈，蛋白質(zhì)降解受損，以及錯誤折疊蛋白質(zhì)的積累。副應激體可能與多種伴侶蛋白和蛋白酶體相關(guān)，這些蛋白在應激下幫助隔離超載的泛素化蛋白質(zhì)。

3.對神經(jīng)退行性疾病的影響：

CASP2在神經(jīng)肌肉去神經(jīng)支配中發(fā)揮作用，缺乏CASP2的小鼠表現(xiàn)出運動神經(jīng)元疾病的常見表型。這表明促進CASP2的激活可能是恢復蛋白酶體功能的一種新方法，并可能為治療ALS提供潛在的策略。

總結(jié)：CASP2作為一種應激半胱天冬酶，不僅在細胞凋亡和存活中具有雙重作用，還在維持泛素穩(wěn)態(tài)和應對細胞應激中發(fā)揮重要作用。其du特的切割模式和在副應激體形成中的角色為理解細胞應激反應提供了新的視角。

參考文獻：

[1] Ge, Y., Zhou, L., Fu, Y. et al. Caspase-2 is a condensate-mediated deubiquitinase in protein quality control. Nat Cell Biol (2024). doi:10.1038/s41556-024-01522-8